【2020 诺贝尔化学奖】基因剪刀 CRISPR:它如何改写人类的生命密码?
2022 1月 17 By binance币安怎么注册下载 0 comment
  • 本文转载自诺贝尔化学奖专题系列,原文为《【2020诺贝尔化学奖】基因剪刀:一个改写生命密码的工具》
  • 译者 / 蔡蕴明|国立台湾大学化学系名誉教授

基因剪刀:一个改写生命密码的工具

艾曼纽尔.夏本提尔(Emmanuelle Charpentier)与珍妮佛.道纳(Jennifer Doudna)荣获了 2020 年诺贝尔化学奖的桂冠,主要是因为她们发现了基因技术中最强大的工具之一:CRISPR/Cas9 基因剪刀。研究人员可以非常精准地使用它们改变动物、植物和微生物的 DNA(去氧核糖核酸)。这个技术彻底改变了分子生命科学,为植物育种带来了新机会、有助於创新的癌症疗法、并可能使治癒遗传性疾病的梦想成真。

科学的吸引力之一是它难以预测——你永远无法预知一个想法或问题会将你引至何处。有时候好奇的心会遇到死胡同,有时则会遇到棘手的迷宫,需要花费多年的时间在其中探索。但是一次又一次地,她意识到自己是第一个凝视着一个未知的可能性从地平线上升起的人。

这个被称为 CRISPR/Cas9 而具有惊人潜力的基因编辑器,就是这样的一个意外发现。当夏本提尔和道纳开始研究一个链球菌属细菌的免疫系统时,一个想法是她们可能开发出一种新的抗生素。相反的,她们却发现了一个分子工具,可用於精准的切割基因物质,使她们可以轻易地改变生命的密码。

一个影响所有人的强大工具

在这个发现後仅仅八年,这些基因剪刀就重塑了生命科学。生物化学家与细胞生物学家现在可以轻易地研究不同基因的功能,以及它们在疾病进展中的可能角色。在植物育种中,研究人员可以赋予植物特定的性质,例如在温暖的气候下具有抗旱能力。在医学上,这个基因编辑器正在为癌症提供新的疗法,以及运用在企图治癒遗传性疾病的首批研究中。

实在有太多的例子是关於 CRISPR/Cas9 如何的使用,其中还包括不道德的应用方法。与所有强大的技术一样,这些基因剪刀需要被管控,有关这部分,後文会有更多说明。

在 2011 年波多黎各的一家咖啡馆里,夏本提尔和道纳都不知道她们的第一次会面,将是一次改变人生的相遇。我们将首先介绍夏本提尔,她是最初建议双方合作的人。

夏本提尔着迷於病原菌

有人曾称赞夏本提尔的积极、专心和慎密,另有些人说她总是在寻找意外的发现。她自己喜欢引用路易.巴斯德(Louis Pasteur)的名言:「机会总是善待那些有准备的心灵」。追求新发现以及对自由和独立的渴望,支配着她走的道路。包括在巴黎巴斯德研究所攻读博士学位在内,她曾待过五个不同的国家,七个不同的城市,以及在十个不同的机构工作。

她的研究环境和方法虽发生了变化,但是她的大部分研究都有一个共同分母:病原菌(pathogenic bacteria)。它们的侵略性为什麽那麽高?它们如何发展出抵挡抗生素的能力?是否可以找到能阻止其进展的新疗法?

2002 年,夏本提尔在维也纳大学成立自己的研究小组时,她专注於对人类造成危害最大的细菌之一:酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。它每年感染数以百万的人,经常引起易於治疗的感染,例如扁桃腺炎(tonsillitis)和脓疱症(impetigo),但是它也可能导致危及生命的败血症,并破坏身体的软组织,而得到「食肉者」的称号。

为了更进一步地了解酿脓链球菌,夏本提尔首先彻底研究了这种细菌如何调控其基因,这决定是发现基因剪刀的第一步——但是在我们进一步跟随她走上这条路之前,我们将先了解更多有关道纳的资讯,因为在夏本提尔对酿脓链球菌进行详细研究的当儿,道纳第一次知晓了一个缩写,她认为其发音听起来就像是英文的 crisper

科学——如侦探故事一般的探险

即便是一个在夏威夷长大的孩子,道纳也强烈渴望了解各种事物。一天,她的父亲把詹姆斯.华生(James Watson)写的书《双螺旋》放在她的床上。这是个具有侦探风格的故事,描述了华生和弗朗西斯.克里克(Francis Crick)如何解开了 DNA 分子的结构。那是个与她在学校教科书中所读过完全不同的故事,她被其中的科学过程所掳获,体会到科学不仅仅是一堆事实而已。

但是当她真正开始解决科学谜团时,她的注意力并非放在 DNA 上,而是它的同胞分子:RNA(核糖核酸)。当我们在 2006 年看着她时,她正在加州大学伯克莱分校领导着一个研究小组,已经拥有了 20 年的 RNA 研究经验,具有开发突破性研究的灵敏嗅觉,并获得非常成功的研究声誉,最近刚进入了一个令人兴奋的新领域:RNA 干扰(RNA interference)。

多年来研究人员一直认为他们了解 RNA 的基本功能,但他们突然发现许多小型 RNA(small RNA)参与了细胞中的基因活性调节。道纳参与的 RNA 干扰研究,导致她在 2006 年接到一通来自不同部门的一位同事的电话。

携带古老免疫系统的细菌

她的同事是微生物学家,告诉了道纳一个新发现:研究人员比较各种极为不同的细菌以及古细菌(一种微生物)的基因物质时,出人意料地,他们发现保存完好的 DNA 重复序列,相同的密码一再重复出现,但是在重复段落之间有着一组独特的不同序列(图 2),就像一本书中各个独特的句子之间,重复着相同的单字。

这些重复序列的阵列称为「群聚且有规律间隔的短回文重复序列」,缩写为 CRISPR。有趣的是,CRISPR 中独特的非重复序列似乎与各种病毒的基因密码匹配,所以目前的想法为:这是古老的免疫系统的一部分,可以保护细菌和古细菌免受病毒侵害。其假说为如果细菌受到病毒感染而成功地存活,它就会将一部分病毒基因密码加入其基因体(genome),作为对感染的记忆。

她的同事说,还没有人知道这一切是如何运作的,但怀疑这种细菌用来中和病毒的机制,类似於道纳研究的课题:RNA 干扰。

道纳绘出了一个复杂的机器

这个消息极不寻常但更令人振奋,如果细菌确实具有一个古老的免疫系统,那麽这极为重要。道纳有着一种栩栩如生的分子计谋感觉,她开始学习有关 CRISPR 系统的所有知识。

研究人员证明除了 CRISPR 序列外,还发现了一些特殊基因,他们将其称为 CRISPR-关联者(CRISPR-associated),简称为 Cas。有趣的是,道纳发现这些基因的编码,与已知专门用於松解和切割 DNA 的蛋白质之基因非常相似。那麽 Cas 蛋白质具有相同的功能吗?它们会切割病毒 DNA 吗?

她让她的研究小组开始工作,几年後,她们成功地揭示了几种不同 Cas 蛋白质的功能。同时,少数几个其它大学的研究小组,也正在研究新发现的 CRISPR/Cas 系统。他们所绘出的图像显示细菌的免疫系统可以采取非常不同的形式,道纳所研究的 CRISPR/Cas 系统属於第 1 类;那是一个复杂的机器,需要许多不同的 Cas 蛋白质来清除病毒。第 2 类系统相当简单,因为它们需要较少的蛋白质。在世界的另一端,夏本提尔刚刚遇到了这样的系统,现在就让我们的故事回到她身边。

CRISPR 系统中一片新而未知的拼图块

当我们的故事离开夏本提尔时,她正住在维也纳,但在 2009 年,她获得了很好的研究机会而搬到了在瑞典北部的於默奥大学(Umeå University)。有人警告她要搬到世界上如此偏远的地区不是个好决定,但是漫长而黑暗的冬天使她工作时充满了平和与宁静。

这正是她需要的。她正好也对调控基因的小型 RNA 感兴趣,并与在柏林的研究人员合作,详细研究了酿脓链球菌中发现的一些小型 RNA。研究的结果让她花了许多时间思考,因为该细菌中一种大量存在的小型 RNA 是一个新的变种,该 RNA 的基因密码与该细菌基因体中奇特的 CRISPR 序列非常类似。

两者之间的相似性让夏本提尔怀疑它们是有关联的,仔细分析它们的基因密码还显示,未知的小型 RNA 的一部分与重复的 CRISPR 相互匹配,就像找到两块完全密合的拼图块一样(图 2)。

夏本提尔从未研究过 CRISPR,但她的研究小组为了厘清酿脓链球菌中的 CRISPR 系统,启动了一些彻底的微生物学侦探工作。这个系统属於已知的第 2 类,仅需一个 Cas 蛋白质:Cas9,即可裂解病毒 DNA。夏本提尔发现,被称为誊本活化 crispr RNA(tracrRNA)的新 RNA 分子,也具有决定性功能;基因体中的 CRISPR 序列所制造出来的长段 RNA,需要 tracrRNA 让它成熟为活性形式(图 2)。

经过深入而有目标性的实验,夏本提尔於 2011 年 3 月发表了 tracrRNA 的发现,她知道自己正尾随着某个精采的东西。她有多年的微生物学经验,但为了持续研究 CRISPR/Cas9 的系统,她希望能与生物化学家合作,道纳则是当然的选择。因此在当年春天,夏本提尔受邀参加在波多黎各举行的会议报告她的发现时,她企图结识这位非常有经验的伯克莱研究人员。

波多黎各咖啡馆中改变人生的会面

碰巧的是,她们在会议的第二天在一家咖啡馆见了面,道纳的同事介绍了她们认识。第二天,夏本提尔提议她们应该一起探索这个首都的旧城区。当她们沿着鹅卵石铺就的街道漫步时,开始谈到彼此的研究,夏本提尔想知道道纳是否对合作感兴趣?她有意参与酿脓链球菌简单的第 2 类系统中,Cas9 功能的研究吗?

道纳很感兴趣,她们和同事们通过线上会议拟定了该研究的计划。她们怀疑 CRISPR RNA 是辨识病毒 DNA 所必需的,而 Cas9 是切断 DNA 分子的剪刀。但是当她们在生物体外进行测试时,什麽都没有发生,DNA 分子仍保持完整。为什麽?实验条件有问题吗?还是说 Cas9 具有完全不同的功能?

经过大量的脑力激荡和无数失败的实验之後,她们的研究人员终於添加了 tracrRNA 进行测试,原先他们认为仅在 CRISPR RNA 被切割成活性形式後,才需要 tracrRNA(图 2),但是一旦 Cas9 可以使用 tracrRNA,大家一直期待的事情真的发生了:DNA 分子被切割成两部分。

大自然透过进化解决问题的方法经常使研究人员感到惊讶,但这次却是非同寻常的,链球菌所发展出的抵御病毒武器,既简单又有效,甚至可谓杰出。基因剪刀的历史可能就此结束:夏本提尔和道纳曾经在一种对人类造成巨大苦难的细菌中,发现了一种细菌的基本机制。光是这发现就已令人惊奇,但机会总是善待那些有准备的心灵。

划时代的实验

研究小组人员决定尝试简化基因剪刀,利用对 tracrRNA 和 CRISPR RNA 的新知识,他们设计出方法将两者融合成一个分子,命名为「向导 RNA」(guide RNA)。利用这种简化的基因剪刀变体,他们接着开始进行划时代的实验:研究是否可以控制这种基因工具,从而於研究人员指定的位置切割 DNA。

此时研究人员知道已经接近了重大突破,他们使用一个已经在道纳实验室的冰柜中存放的基因,并选择了五个不同的基因切割位置,然後更改剪刀的 CRISPR 部分,使其密码与进行切割位置的密码匹配(图 3),结果是势不可挡的将 DNA 分子切割在正确的位置。

基因剪刀改变了生命科学

夏本提尔和道纳在 2012 年发表 CRISPR/Cas9 基因剪刀的发现後不久,这个工具被多个研究小组展示可用於修饰小鼠和人类细胞中的基因体,导致爆炸性的发展。先前,改变细胞、植物或生物体中的基因非常耗时,有时甚至是不可能的。使用这种基因剪刀,研究人员原则上可以在他们想用的任何基因体中进行切割。接着可以很容易利用细胞的天然 DNA 修复系统,从而改写生命密码(图 3)。

由於这种基因工具非常易於使用,现在广泛的应用於基础研究中。它可用於更改细胞和实验动物的 DNA,以了解不同基因的功能和相互的作用,例如在疾病过程中的角色。

基因剪刀也已成为植物育种的标准工具,以前研究人员修改植物基因体使用的方法,通常需要添加抗生素耐药性基因,但种植这种农作物时,其抗生素耐药性可能会扩散给周围微生物。多亏了基因剪刀,研究人员不再需要使用这些较旧的方法,因为他们现在可以对基因体进行非常精确的更改。许多其它应用中,他们还编辑了使水稻吸收土壤中重金属的基因,使得改良的水稻品种具有较低的镉和砷的含量。研究人员还开发了在温暖的气候中更能抵抗乾旱的农作物,并且可以抵抗昆虫和害虫,否则将不得不使用农药。

遗传疾病治癒的希望

在医学上,基因剪刀为癌症的新免疫疗法做出了贡献,实验正在企图让梦想实现——治癒遗传疾病。研究人员已经在进行临床试验以研究是否可以使用 CRISPR/Cas9 来治疗一些血液疾病,例如镰形血球贫血症和 beta-地中海型贫血症,以及遗传性眼疾。

他们也在开发修复大型器官中基因的方法,例如大脑和肌肉。动物实验显示,经过特殊设计的病毒可以将基因剪刀导入需要的细胞,作为治疗毁灭性遗传疾病的模型,例如肌肉失养症,脊髓肌肉萎缩和杭丁顿舞蹈症。但是该技术仍需要进一步改善,使之能在人体上进行测试。

基因剪刀的能力需要监控

与其所有优点并存的,基因剪刀也可能被滥用。例如,可以使用此工具创造基因修饰过的胚胎。但是,多年来有法律及法规控制基因工程的应用,其中包括禁止会让变化遗传给後代的人类基因体修改方式。另外,涉及人类和动物的实验,必须经过道德委员会的审查和批准才得执行。

可以肯定的是:这些基因剪刀影响着我们所有人。我们将面临新的伦理问题,但是此一新的工具很可能有助於解决当今人类面临的许多挑战。通过她们的发现,夏本提尔和道纳开发了一种化学工具,将生命科学带入了一个新时代。她们使我们注视着无法想像的广阔前景,并且,在我们探索这片新领域的过程中,一定会创造出新的和意想不到的发现。

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